Metodologia
Detecção de seqüência, ou como é comumente conhecido um PCR em Tempo Real, extremamente versátil que realiza a análise de diferentes aplicações no estudo da biologia molecular.

  O método determina  a quantidade inicial de um produto (DNA/RNA) através do comportamento da cinética de amplificação das diferentes fases ao longo dos ciclos de uma PCR, ou seja, detecta e quantifica, em tempo real, ácidos nucléicos enquanto são amplificados, sem a necessidade de realizar purificação e análises adicionais.

 A cinética de amplificação é divida em 3 fases :
 Fase geométrica : caracteriza-se por apresentar alta precisão na duplicação do número de moléculas da reação.
 Fase linear : a taxa de produção de novas cadeias de DNA via PCR passa gradualmente de uma progressão geométrica para progressão linear.
 Fase de platô : a eficiência de amplificação cai drasticamente para níveis insignificantes, com baixa ou nenhuma produção de novas cadeias de DNA.

 Para se detectar o aumento de produto de uma PCR ao longo de cada ciclo, é preciso marcar o DNA amplificado com algum tipo de molécula fluorescente (Exemplo : SYBR TM Green e TaqMan TM).

Aplicações
Quantificação de Carga Viral
  Hepatite C, Hepatite B, Herpes, HIV, entre outros.
Expressão Gênica
  Marcadores moleculares para diversos tipos de câncer
Detecção de Transgênicos
  Soja, milho, arroz etc.
Análise de Resíduos de OGMs em Alimentos no INCQS
 Saúde Humana, Animal; Processamento de Alimentos, Gerenciamento Ambiental e Tecnologia Agrícola.
Detecção de Patógenos (“end point”)
  HIV, Hepatite B, Hepatite C, Citomegalovírus, Toxoplasma gondii, entre outros.
Descriminação alélica (SNPs) (“end point”)

Vantagens do  Real Time sobre as tradicionais técnicas de PCR
 Atualmente, o uso da PCR por tempo real (Real Time) incorpora a detecção de sinais enquanto ocorre a amplificação. Para isso, utilizam-se oligonucleotídeos e sondas específicas que emitem fluorescência a cada hibridização e a cada passo de amplificação. Por detectar regiões específicas, essa técnica permite uma rápida e precisa quantificação de organismos infecciosos ou seqüências transgênicas. Este novo conceito eliminou todas as fases de análise pós-PCR2. O software associado ao método garante precisão a partir de limiares muito baixos de detecção.

 O PCR em tempo-real ou real-time PCR.  Utiliza detecção com química fluorescente (oligonucleotídeos e sondas específicas marcadas). O método é mais sensível (aumentando a sensibilidade em até 7 vezes quando comparado com o PCR tradicional), mais rápido, oferece maiores controles de qualidade, permite auditar o processo de amplificação e elimina a contaminação no laboratório. A contaminação é motivo de grande preocupação para laboratórios que empregam métodos como PCR e a pouca chance de contaminação com real-time PCR se dá porque o tubo de reação não precisa ser aberto ao seu final (já que a detecção ocorre on-line, durante os ciclos de amplificação)1.

O plot da amplificação mostra a mudança de log na fluorescência do reporter versus o número de ciclos do PCR. Esse plot do sistema 7300 ilustra 9 logs de dinâmica linear para o teste da TaqMan de um DNA plasmidial contendo a sequência alvo hCCNB1 em uma diluição seriada de dez vezes (o hCCNB1 é humana g2/ciclina específica mitótica b1, chromossome 5, 5q12).


Ensaios multiplex com a TaqMan no sistema 7300 mostrando a amplificação de cDNA (96 amostras) usando sondas marcadas com os repórteres VIC (verde) e FAM (preto) para as sequências alvo 18S e TGF-beta, respectivamente.